生物化学与分子生物学实验

一、课程简介

实验总学时： 90             实验周学时： 8

开设实验项目数：14          实验课学分： 4.5

本课程面向生命科学学院生物技术专业学生开设，为必修课，属于专业基础实践教学课程。根据课程的性质、任务及要求，课程内容分综合性实验，选修实验以及课程讨论等，由学生自行操作实验并由教师指导，进行多层次，多方式教学的全面训练。

二、教学目标和要求

    生物化学与分子生物学实验技术不仅是生物化学教学重要的组成部分，而且在培养学生分析和解决问题的能力，严谨的科学态度和独立工作的能力方面，有着不可替代的作用。

针对学生的培养方向，本课程以培养学生掌握生物技术与分子生物学研究的基础实验技能为主要目标，力图最大限度地利用我校现有的实验条件，使学生通过本课程的学习和实践，接触和掌握从事生物技术研究所必要的实验手段。通过有限的实验室实践，涵盖生物化学与分子生物学各个方面的实验内容，以点带面，突出重点，促进学生对生物化学与分子生物学课程学习内容的理解和掌握。

    本课程教学中，实验技术原理采取以学生自习为主，课堂进行提要式的提示讲解和必要的答疑的方式，使学生掌握实验方法的基本原理和应用范围。本课程强调实验技能训练的重要性，主要课时安排学生实验，以便尽量提高学时利用率。为了节省基础设施投资，提高仪器利用率，本课程采取开放式集中实验的方式，要求学生在实施实验之前，必须做好预习准备，拟好实验方案，经任课教师认可后，方可进入实验室做实验。

三、与相关课程的联系和分工

分子生物学和生物工程学是两门新兴的学科，无论对基础理论研究，还是生产实践都将产生巨大的影响。生物化学与分子生物学是这两门学科的重要基础，是一门实践性很强的实验课程。掌握和应用生物化学与分子生物学实验技能，是学好这些课程的必要条件。

四、教学方法和考核形式

本课程的考核方法从整个实验预习、实验操作过程、理论考试、实验技能操作考试等多角度评价学生的综合实验能力。

在课程成绩评定上，采取实验报告、实验参与、讨论分析、基础理论和实验技能相结合的综合评定方式，各部分比例根据实际情况适当调整。

五、实验教学内容

实验项目一：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

1、目的与要求：掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。

2、实验原理：SDS以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷、椭圆形或棒状结构的蛋白质-SDS复合物，从而消除或大大降低了不同蛋白质之间所带净电荷的不同对电泳迁移的影响。

3、实验所需仪器设备：蛋白样品，电磁炉，垂直板电泳槽及附件，稳流稳压电泳仪，冷冻离心机，凝胶成像仪，组织匀浆器，制冰机，移液器等。

4、实验步骤：（1）电泳槽的安装（2）样品的处理（3）点样（4）电泳（5）固定和染色

5、实验结果分析。

 实验项目二：考马斯亮蓝G–250染色法测定蛋白质含量

1、目的与要求：掌握考马斯亮蓝（Bradford）G-250染色法测定蛋白质浓度的方法。

2、实验原理： Bradford染色法测定蛋白质浓度的原理。

3、实验所需仪器设备和材料：蛋白样品，分光光度计，离心机等。

4、实验步骤：（1）标准曲线的绘制（2）样品配制（3）分光光度计测定

5、实验结果分析。

 实验项目三：植物组织中可溶性糖的薄层层析分离与鉴定

1、目的与要求：采用硅胶G薄层层析法，分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类，掌握吸附薄层层析的原理，操作及其在糖类鉴定中的作用。

2、实验原理：吸附薄层层析，根据吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，因此个组分的移动速度不同，从而达到分离混合物的目的。

3、实验所需仪器设备：水果，离心机及离心管、天平、恒温水浴、毛细管、层析缸、吹风机、烘箱、喷雾器、烧杯、硅胶GF254薄层层析板等。

4、实验步骤：（1）硅胶板活化（2）水果中可溶性糖提取液的制备（3）点样（4）展层（5）显色

5、实验结果分析：量出原点至溶剂前沿，以及各斑点中心的距离，计算出它们的Rf值。

 实验项目四：马铃薯多酚氧化酶制备及性质

1、目的与要求：掌握从组织细胞中提取制备粗酶液的方法，分析基本影响。

2、实验原理：探讨底物种类、底物浓度、抑制剂和蛋白质变性剂对多酚氧化酶活性的影响。

3、实验所需仪器设备和材料：马铃薯，电子天平，移液器，水浴锅，离心机等。

4、实验步骤：（1）多酚氧化酶的分离提取（2）多酚氧化酶底物专一性分析（3）多酚氧化酶的化学性质分析

5、实验结果分析。

 实验五：菌类多糖的分离提取与含量测定

1、目的与要求：熟悉菌类多糖的提取及苯酚-硫酸法测定其含量。

2、实验原理：水浸提后加入有机溶剂进行沉淀的方法提取菌类多糖，苯酚-硫酸反应测菌类多糖含量。

3、实验所需仪器设备和材料：食用菌，分光光度计，水浴锅，天平，组织粉碎机，细胞破碎仪，真空泵，电热鼓风干燥箱，真空干燥箱，离心机等。

4、实验步骤：（1）菌类多糖的分离提取（2）菌类多糖含量测定

5、实验结果分析。

 实验项目六：植物总DNA的提取（CTAB法）

1、目的与要求：掌握CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术，以及紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度的方法。

2、实验原理： CTAB法提取植物总DNA的基本原理。

3、实验所需仪器设备和材料：恒温水浴锅，分光光度计，离心机等。

4、实验步骤：（1）植物材料液氮研磨（2）提取DNA（3）分光光度法测定

5、实验结果分析。

 实验项目七：植物总RNA的提取和含量测定

1、目的与要求：掌握Trizol法提取RNA的原理及操作技术。

2、实验原理：Trizol提取总RNA的基本原理。

3、实验所需仪器设备和材料：植物叶片、超净工作台，冷冻高速离心机，制冰机等。

4、实验步骤：（1）植物材料液氮研磨（2）Trizol提取总RNA（3）电泳技术或光谱技术检测RNA的浓度、纯度

5、实验结果分析。

 实验项目八：质粒DNA的提取

1、目的与要求：掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。

2、实验原理：碱裂解法提取质粒的基本原理。

3、实验所需仪器设备和材料：含有目标质粒DNA的大肠杆菌细胞，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅，制冰机等。

4、实验步骤：（1）细菌培养（2）碱裂解提取质粒

5、实验结果分析。

 实验项目九：PCR基因扩增

1、目的与要求：学习和掌握PCR反应的基本原理与实验技术。

2、实验原理：多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）基本原理。

3、实验所需仪器设备和材料：DNA模板，PCR反应试剂，PCR热循环仪，制冰机等。

4、实验步骤：（1）混合试剂（2）上机反应（3）琼脂糖电泳分析结果

5、实验结果分析。

 实验项目十：琼脂糖凝胶电泳

1、目的与要求：掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术和原理。

2、实验原理：感受态细胞和转化原理。

3、实验所需仪器设备和材料：待检测的DNA，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统等。

4、实验步骤：（1）制备琼脂糖凝胶（2）胶板的制备（3）加样（4）电泳

5、实验结果分析。

 实验项目十一：表达载体的构建

1、目的与要求：掌握限制性内切酶酶切技术，掌握目的片段的胶回收、纯化过程和T载体连接。

2、实验原理：限制性内切酶酶切原理。

3、实验所需仪器设备和材料：待分析的质粒DNA，电泳仪，电泳槽，恒温水浴锅，凝胶成像系统等。

4、实验步骤：（1）配酶切体系（2）琼脂糖电泳检测（3）切胶（4）纯化目的DNA片段（5）T载体连接

5、实验结果分析。

 实验项目十二： 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

1、目的与要求：掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的和热激转化实验技术。

2、实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中的分离及大分子核酸染料染色检测核酸原理。

3、实验所需仪器设备和材料：大肠杆菌菌株JM109细胞，待转化的重组DNA分子（含有Ampr），超净工作台，冷冻高速离心机，恒温摇床，恒温培养箱，恒温水浴器，高压灭菌锅等。

4、实验步骤：（1）细菌培养（2）感受态细胞制备（3）转化

5、实验结果分析。

 实验项目十三：绿色荧光蛋白的原核表达

1、目的与要求：掌握乳糖操纵子基因表达的调控机制和蛋白质原核生物诱导表达技术。

2、实验原理：原核表达的基本原理。

3、实验所需仪器设备和材料：大肠杆菌，超净工作台，恒温摇床，恒温培养箱，高压灭菌锅等。

4、实验步骤：（1）细菌培养（2）蛋白诱导表达（3）荧光显微镜观察

5、实验结果分析。

实验项目十四：His-tag融合蛋白的亲和层析纯化

1、目的与要求：掌握his-tag亲和色谱的原理和操作方法。

2、实验原理：超声波细胞破碎的基本原理，以及his-tag亲和色谱的原理。

3、实验所需仪器设备和材料：诱导培养的E. coli细胞液，超声波细胞破碎仪，紫外核酸蛋白检测仪，制冰机，紫外分光光度计等。

4、实验步骤：（1）细胞超声波破碎（2）蛋白亲和层析纯化

5、实验结果分析。

选修实验：

    本实验为综合性实验，涵盖本课程实验的多个方面，可供学有余力且有兴趣的同学在完成本课程的基础上选择完成。

实验项目：酵母蔗糖酶的分离纯化

1、目的与要求：掌握乙醇分级沉淀分离纯化粗酶抽提液的方法，以及离子交换层析的原理和操作。

2、实验原理：提取和纯化各种方法的基本原理。

3、实验所需仪器设备和材料：酵母粉，冷冻离心机，恒温水浴锅，分析天平，制冰机，沸水浴，计时器，可见分光光度计，层析柱（规格为内径1.5cm×高25cm），恒流泵，记录仪，部分收集器，核酸蛋白紫外检测仪，真空泵

4、实验步骤：（1）葡萄糖标准曲线的制作（2）蛋白质标准曲线的制作（3）蔗糖酶粗酶抽提液的制备（4）乙醇分级分离（5）DEAE-纤维素柱层析（6）蔗糖酶的活力及蛋白浓度测定

5、实验结果分析。

六、实验教材和参考资料

甘纯玑 崔喜艳 主编， 2014，生物化学与分子生物学实验，高等教育出版社